专家论坛｜邓国宏：慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞：耗竭还是沉默？ 原创 临床肝胆病杂志  临床肝胆病杂志  今天 慢性HBV感染是我国最主要的人类病毒慢性感染，波及8%左右的人口。其免疫损伤导致的慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝癌发生率居高不下。我国慢性HBV感染面临的根本问题在于，大部分患者因母婴传播于婴幼儿时期感染，表现为长期的免疫耐受，病毒难以清除［1］。慢性HBV感染长达数十年的自然史依次出现免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和HBeAg阴性肝炎活动期四个典型阶段。 免疫耐受的概念来源于机体针对自身抗原免疫应答的研究，指机体无法对特定抗原产生有效的免疫应答。该定义很好地描述了慢性HBV感染者早期高病毒载量、无明显肝损伤的现象。弄清慢性HBV感染发生免疫耐受的机制，对于临床上实现乙型肝炎功能性治愈具有重大意义。 1  慢性HBV感染针对病毒的免疫耐受源自T淋巴细胞耗竭——证据及疑惑 基于急性HBV感染者的研究发现，病毒清除过程与HBV特异性T淋巴细胞应答紧密相关［2-4］。基于急性HBV感染黑猩猩模型的研究［5］揭示了T淋巴细胞（特别是CD8 T淋巴细胞）在HBV清除及肝损伤中的核心作用。考虑到上述HBV急性感染中的发现，慢性HBV感染针对病毒的免疫耐受源自HBV特异性T淋巴细胞异常就是一个合理的推测。而HBV特异性T淋巴细胞（特别是CD8 T淋巴细胞）也是近年来慢性HBV感染研究领域的一大热点。 相对于急性HBV感染者，慢性HBV感染者HBV特异性T淋巴细胞在数量、表型及功能上都有诸多不同：首先，该类患者HBV特异性T淋巴细胞数量很少，一般需要HBV抗原体外刺激扩增之后才能稳定检测到［6］；其次，该类患者HBV特异性T淋巴细胞高表达PD-1、CTLT-4、TIM3、Bim等免疫抑制分子，而体外阻断这些抑制分子，能一定程度上恢复HBV特异性T淋巴细胞的功能［6-10］。 慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）感染小鼠模型是研究慢性病毒感染的经典模型。基于该模型的研究结果定义了T淋巴细胞由于抗原持续刺激导致数量减少、功能下调的状态——T淋巴细胞耗竭［11］。慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞数量、表型及功能上的特性非常契合T淋巴细胞耗竭的定义。当前主流观点也认为慢性HBV感染对于病毒的免疫耐受来源于长期HBV抗原刺激导致的T淋巴细胞耗竭。然而，T淋巴细胞耗竭的假说，无法与慢性HBV感染临床上观察到的一些现象相吻合。 首先，T淋巴细胞耗竭是由于持续性抗原刺激造成的，其程度与抗原载量呈正比［12］。据此推断，处于免疫耐受期的患者由于极高病毒载量，其HBV特异性T淋巴细胞耗竭程度应该最高。然而研究［13］发现，该类患者相对于其他期患者，其HBV特异性T淋巴细胞数量并没有明显降低，且功能相对更加完整。 其次，慢性LCMV感染模型揭示CD8 T淋巴细胞耗竭是一个渐进性功能受损过程：首先受损的是介导溶胞的细胞毒作用，随之是IL-2分泌能力，然后是TNFα分泌能力，最后是IFNγ分泌能力［14］。CD4 T淋巴细胞耗竭过程中细胞因子分泌受损模式与CD8 T淋巴细胞类似［15］。由此推断，慢性HBV感染者病毒特异性CD8 T淋巴细胞如果是耗竭状态，那么其通过细胞毒作用介导肝损伤的能力应该很弱。而临床上慢性HBV感染者一旦脱离免疫耐受期，如果不利用核苷类似物抗病毒，则非常容易发生肝损伤。如果认可CD8 T淋巴细胞在肝损伤中的核心作用，那么上述现象间接提示，慢性HBV感染者中病毒特异性CD8 T淋巴细胞耗竭程度是非常有限的。 再次，对于慢性HBV感染急性发作的患者，其呈现为高病毒载量、急性肝损伤。笔者和其他学者［16-19］的研究都发现该类患者大量HBV特异性T淋巴细胞活化，部分患者随后会发生HBeAg甚至HBsAg清除。说明这些患者尽管HBV高载量，然而其T淋巴细胞介导肝损伤和病毒清除的功能是比较完整的。可以用耗竭T淋巴细胞功能恢复来解释慢性HBV感染急性发作过程中肝损伤及后续病毒清除，但该假设很难解释为何T淋巴细胞功能恢复反而伴随HBV载量短期大幅提升。 最后，临床试验结果显示，针对HBeAg阴性、HBsAg低水平的患者，经PD-1抗体治疗后HBsAg清除率不到5%［20］。而对于该类患者，聚乙二醇长效干扰素治疗可使高达30%的患者实现HBsAg清除［21］。上述结果说明，PD-1分子上调导致的T淋巴细胞耗竭并不是慢性HBV感染无法清除病毒的主要原因。 2  慢性HBV感染中病毒特异性T淋巴细胞由分化早期的T淋巴细胞主导 近年来，基于慢性LCMV感染小鼠模型发现了一群TCF1+CXCR5+PD-1+的CD8 T淋巴细胞，这群细胞显示出一定的干性，能进一步分化为耗竭的T淋巴细胞［22］。而在肿瘤患者中的研究也发现这群干细胞样的CD8 T淋巴细胞，该群细胞在抗原递呈细胞的刺激下有效进一步分化，与患者经PD-1抗体治疗后良好预后紧密相关［23］。 如果慢性HBV感染病毒特异性T淋巴细胞不是由耗竭的T淋巴细胞主导，那么该如何定义这群T淋巴细胞的功能状态？笔者深入分析了慢性HBV感染静息期、慢性HBV感染急性发作患者的HBV特异性CD4 T淋巴细胞应答，发现HBV特异性CD4 T淋巴细胞以TNFα+细胞为主，该群细胞在高炎症患者中大量活化且与患者肝损伤协同变化；而TNFα+细胞向IFNγ+细胞的分化则利于患者病毒清除，该分化过程伴随着T淋巴细胞特化转录因子T-bet、效应分子IL-21的上调［19］。有研究［24］在HBV特异性CD8 T淋巴细胞中也观察到T-bet分子下调，但将其归因于T淋巴细胞耗竭。笔者认为，慢性HBV感染者中占主导地位的TNFα+ CD4 T淋巴细胞很可能是处于早期分化、具有一定干性的T淋巴细胞，理由如下：（1）该群细胞细胞因子谱是TNFα+ IFNγ－，这与耗竭T淋巴细胞的细胞因子谱（TNFα－IFNγ+）截然相反［25］，而慢性LCMV感染小鼠模型中具有干性的TCF1+CXCR5+PD-1+的CD8 T淋巴细胞其细胞因子谱与笔者研究发现的这群细胞类似，为TNFα+ IFNγdim［22］；（2）笔者前期对ATAC-seq数据库中的CD4 T淋巴细胞数据进行了分析，发现TNFα启动子区存在转录因子TCF-1特异结合元件，而TCF-1是维持血液细胞（包括T淋巴细胞）干性的关键转录因子［26-27］；（3）笔者通过对慢性HBV感染急性发作患者的多点跟踪，观察到这群细胞向IFNγ+细胞分化的现象，说明这群细胞具有可分化性。 综合笔者的发现及其他学者在慢性LCMV感染小鼠模型及肿瘤患者中的发现，可得出以下判断，慢性HBV感染者病毒特异性CD4 T淋巴细胞以TNFα+细胞为主导，该群细胞具有一定的干性，其向IFNγ+细胞的分化则利于患者病毒清除。而慢性HBV感染者病毒特异性CD8 T淋巴细胞是否也是类似情况？笔者认为可能性很大，不过目前并没有相关研究证据。 当然，慢性HBV感染者中也有耗竭的T淋巴细胞，该群细胞细胞因子谱根据当前对T淋巴细胞耗竭的研究来判断应该为TNFα－IFNγ+［14-15,25］，从笔者的研究数据来看，该群细胞在患者中并不占主导。前人研究把HBV特异性IFNγ+ T淋巴细胞数量提升归因于耗竭T淋巴细胞的功能修复，目前看来，这群细胞数量提升很大部分可能来自于TNFα+细胞的分化。 3  慢性HBV感染中病毒特异性T淋巴细胞未能进一步分化的可能原因 慢性HBV感染病毒特异性分化早期的TNFα+ T淋巴细胞为何没有进一步分化，反而处于静息沉默状态？笔者认为原因可能在于天然免疫系统。与EB病毒、巨细胞病毒、HCV等在感染初期即出现病毒快速扩增、天然免疫的迅速激活不同，HBV难以激发天然免疫模式识别受体，表现为天然免疫难以识别的“隐形病毒”［28-29］。而对于慢性HBV感染急性发作患者的研究发现，在发病早期，肝脏炎症反应以天然免疫活化为主。检测不到HBV特异性IFNγ+ T淋巴细胞应答，这说明患者天然免疫系统即使活化了，也主要参与介导肝脏炎症损伤，很难有效激发HBV特异性T淋巴细胞应答以清除病毒［30］。体外刺激HBV特异性CD4 T淋巴细胞上OX40分子（抗原递呈细胞上共刺激分子OX40L的配体）、同时阻断PD-1分子，能显著提升HBV特异性 IFNγ+及IL-21+ CD4 T淋巴细胞的数量，这提示给予适当的天然免疫信号刺激，能有效诱导HBV特异性CD4 T淋巴细胞的进一步分化［31］。 4 展望 慢性HBV感染者T淋巴细胞到底是耗竭的T淋巴细胞主导，还是处于分化早期具有一定干性的沉默T淋巴细胞主导？弄清这个问题非常重要，这直接关系到感染免疫研究方向及临床治疗策略的选择。如果是前者，那么就应该进一步研究HBV特异性T淋巴细胞耗竭的机制，临床免疫治疗策略应聚焦于耗竭T淋巴细胞的功能逆转；如果是后者，那么就应该深入研究处于分化早期的沉默T淋巴细胞进一步分化的机制，临床免疫治疗策略则应聚焦于促进该群T淋巴细胞进一步向清除病毒方向分化。随着目前研究手段的日益精进（单细胞测序、质谱流式等高内涵平台的应用）、研究内容的日益深入，相信这个问题在不久的将来能得到更令人信服的答案。 参考文献: ［1］LIAW YF, CHU CM. Immune tolerance phase of chronic hepatitis B［J］. Gastroenterology, 2017, 152(5): 1245-1246. ［2］PENNA A, ARTINI M, CAVALLI A, et al. Long-lasting memory T cell responses following self-limited acute hepatitis B［J］. J Clin Invest, 1996, 98(5): 1185-1194. ［3］REHERMANN B, FOWLER P, SIDNEY J, et al. The cytotoxic T lymphocyte response to multiple hepatitis B virus polymerase epitopes during and after acute viral hepatitis［J］. J Exp Med, 1995, 181(3): 1047-1058. ［4］FERRARI C, PENNA A, BERTOLETTI A, et al. Cellular immune response to hepatitis B virus-encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection［J］. J Immunol, 1990, 145(10): 3442-3449. ［5］THIMME R, WIELAND S, STEIGER C, et al. CD8(+) T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection［J］. J Virol, 2003, 77(1): 68-76. ［6］BONI C, FISICARO P, VALDATTA C, et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection［J］. J Virol, 2007, 81(8): 4215-4225. ［7］BENGSCH B, MARTIN B, THIMME R. Restoration of HBV-specific CD8+ T cell function by PD-1 blockade in inactive carrier patients is linked to T cell differentiation［J］. J Hepatol, 2014, 61(6): 1212-1219. ［8］SCHURICH A, KHANNA P, LOPES AR, et al. Role of the coinhibitory receptor cytotoxic T lymphocyte antigen-4 on apoptosis-Prone CD8 T cells in persistent hepatitis B virus infection［J］. Hepatology, 2011, 53(5): 1494-1503. ［9］LOPES AR, KELLAM P, DAS A, et al. Bim-mediated deletion of antigen-specific CD8 T cells in patients unable to control HBV infection［J］. J Clin Invest, 2008, 118(5): 1835-1845. ［10］PARK JJ, WONG DK, WAHED AS, et al. Hepatitis B virus-specific and global T-cell dysfunction in chronic hepatitis B［J］. Gastroenterology, 2016, 150(3): 684-695.e5. ［11］WHERRY EJ. T cell exhaustion［J］. Nature Immunol, 2011, 12: 492-499. ［12］MUELLER SN, AHMED R. High antigen levels are the cause of T cell exhaustion during chronic viral infection［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(21): 8623-8628. ［13］KENNEDY P, SANDALOVA E, JO J, et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B［J］. Gastroenterology, 2012, 143(3): 637-645. ［14］WHERRY EJ, BLATTMAN JN, MURALI-KRISHNA K, et al. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment［J］. J Virol, 2003, 77(8): 4911-4927. ［15］BROOKS DG, TEYTON L, OLDSTONE MB, et al. Intrinsic functional dysregulation of CD4 T cells occurs rapidly following persistent viral infection［J］. J Virol, 2005, 79(16): 10514-10527. ［16］RIVINO L, LE BERT N, GILL US, et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos(t)ide-analogue therapy discontinuation［J］. J Clin Invest, 2018, 128(2): 668-681. ［17］RINKER F, ZIMMER CL, HNER ZU SIEDERDISSEN C, et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B［J］. J Hepatol, 2018, 69(3): 584-593. ［18］TSAI SL, CHEN PJ, LAI MY, et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion［J］. J Clin Invest, 1992, 89(1): 87-96. ［19］WANG H, LUO H, WAN X, et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection［J］. J Hepatol, 2020, 72(1): 45-56. ［20］VERDON D, BROOKS A, GAGGAR A, et al. Immunological assessment of HBeAgnegative chronic hepatitis B patient responses following anti-PD-1 treatment［J］. Hepatology, 2017, 66:23A. ［21］CAO Z, LIU Y, MA L, et al. A potent hepatitis B surface antigen response in subjects with inactive hepatitis B surface antigen carrier treated with pegylated-interferon alpha［J］. Hepatology, 2017, 66(4): 1058-1066. ［22］IM SJ, HASHIMOTO M, GERNER MY, et al. Defining CD8+ T cells that provide the proliferative burst after PD-1 therapy［J］. Nature, 2016, 537(7620): 417-421. ［23］JANSEN CS, PROKHNEVSKA N, MASTER VA, et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells［J］. Nature, 2019, 576(7787): 465-470. ［24］KURKTSCHIEV PD, RAZIORROUH B, SCHRAUT W, et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction［J］. J Exp Med, 2014, 211(10): 2047-2059. ［25］CRAWFORD A, ANGELOSANTO JM, KAO C, et al. Molecular and transcriptional basis of CD4+ T cell dysfunction during chronic infection［J］. Immunity, 2014, 40(2): 289-302. ［26］WU JQ, SEAY M, SCHULZ VP, et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line［J］. PLoS Genet, 2012, 8(3): e1002565. ［27］ZHOU X, YU S, ZHAO DM, et al. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1［J］. Immunity, 2010, 33(2): 229-240. ［28］SUSLOV A, BOLDANOVA T, WANG X, et al. Hepatitis B virus does not interfere with innate immune responses in the human liver［J］. Gastroenterology, 2018, 154(6): 1778-1790. ［29］VYAS AK, JINDAL A, TREHANPATI N. Ponder the innate immunity in hepatitis B infection［J］. Gastroenterology, 2018, 155(4): 1277. ［30］TAN AT, KOH S, GOH W, et al. A longitudinal analysis of innate and adaptive immune profile during hepatic flares in chronic hepatitis B［J］. J Hepatol, 2010, 52(3): 330-339. ［31］JACOBI FJ, WILD K, SMITS M, et al. OX40 stimulation and PD-L1 blockade synergistically augment HBV-specific CD4 T cells in patients with HBeAg-negative infection［J］. J Hepatol, 2019, 70(6): 1103-1113. 点击下方“阅读原文”，下载本文完整PDF 引证本文：王昊亮, 邓国宏. 慢性HBV感染者病毒特异性T淋巴细胞：耗竭还是沉默？[J]. 临床肝胆病杂志, 2020, 36(5): 980-982. 本文编辑：朱晶 公众号编辑：邢翔宇 阅读原文 更多内容vip可查看